Монастырь расположен на Столбенском острове озера Селигер, на месте отшельнического подвига преподобного Нила Столобенского, в 10 км от города Осташкова. В 1528 году на острове Столобном озера Селигер поселился отшельник Нил Столобенский. До этого в течении тринадцати лет он жил в дремучем лесу на берегу реки Серемхи, но там не смог спрятаться от людской славы. В первый год жизни на острове он выкапывает в горе небольшую пещеру, где проводит зиму. В 1529 году он строит на острове хижину и часовню. 7 декабря 1554 года преподобный Нил скончался, в 1560 году над его могилой была возведена часовня. В 1591 году на остров приходит иеромонах Герман, который течении нескольких лет и при помощи нескольких человек возводит на острове деревянную церковь в честь Богоявления Господня с пределом во имя святого Василия Блаженного. В 1594 году "островитяне" получают благословенную грамоту патриарха Московского и всея Руси Иова на открытие монастыря Нилова пустынь, этот год становится годом основания монастыря. В 1610 году монастырь был разорен в результате литовского нашествия. В 1622 году в монастыре была возведена вторая деревянная пятиглавая церковь Покрова Пресвятой Богородицы. В 1635 году на месте сгоревшего первого храма Богоявления Господня был возведен новый деревянный храм. Также на территории монастыря были устроены больничные и гостиные кельи, монастырь обнес оградой, а над воротами поставил новую восьмистенную колокольню, на которой были установлены часы с боем. В 1665 году в монастыре произошел пожар, который уничтожает дотла все основные постройки монастыря. На его восстановление царь пожертвовал 200 рублей, кроме того, обитель к тому времени и сама уже располагала немалыми средствами. 27 мая 1667 года при закладке нового каменного Богоявленского собора были обнаружены нетленные мощи прп. Нила Столобенского. В 1671 году завершается возведение первого каменного Богоявленского собора и в него переносятся святые мощи преподобного Нила. В 1680-1698 годах была построена Казенная палата с казначейскими кельями. В 1751 году к палате пристроили архиерейские кельи. В 1699-1701 годах северо-западном углу соборного двора был возведен храма преподобного Нила, который позднее стал храмом Всех Святых. Наиболее интенсивное строительство велось в монастыре в XVIII веке. Руководил работами подрядчик Фома Павлов, крестьянин подмонастырской слободы Троицкого Селижаровского монастыря, высокоодаренный мастер. Более десяти лет он проработал в Ниловой пустыни. На месте старых Святых ворот Фома Павлов возвел в 1751-1755 годах каменную надвратную церковь во имя преподобного Нила Столобенского, напоминающую надвратную церковь Донского монастыря в Москве. До 1832 года она была увенчана пятью главами, четыре из которых были разобраны. В 1760-1764 годах была построена надвратная церковь во имя апостолов Петра и Павла над восточными воротами. Иконы для ее погибшего иконостаса писал Б.Е. Уткин — представитель известной фамилии осташковских иконописцев. В 1764 году обитель стала одной из немногих, причисленных к первому классу. Видимо свою роль в этом сыграла канонизация преподобного Нила, которая состоялась в 1756 году. В 1777-1781 годах иждивением помещика Ивана Сергеевича Челищева была построена церковь Иоанна Предтечи, которая была освященная 27 декабря 1781 года архимандритом обители Иоанникием. В 1782 году начали сооружать двухэтажный корпус для почетных гостей, который закончили только в конце XVIII века. В то же время был построен трехэтажный странноприимный дом. В 1784-1788 годах в стороне от главных построек монастыря, на небольшом мысу, была сооружена Крестовоздвиженская церковь. Ее великолепное лепное убранство было выполнено осташковским мастером Кондратием Конягиным. В XVIII веке Нило-Столобенская пустынь была едва ли не самым почитаемым монастырем во всем Верхневолжье. В 1820 году её посетил император Александр I Павлович. А через год в монастыре развернулось активное строительство, и многие постройки той поры сохранились до наших дней. В 1833 году возводится новый каменный Богоявленский собор. А в 1838 году проводится реконструкция строений соборного двора. В 1851 году вокруг острова Столобный сооружается гранитная набережная. В начале XX века Нилова пустынь была вторым в мире по посещаемости местом паломничества после Гроба Господня. Однако после прихода в 1917 году к власти в России большевиков ее жизнь быстро пошла на спад. 25 февраля 1919 года была кощунственно вскрыта рака с мощами преподобного Нила Столобенского. А позднее его мощи были вывезены из обители и помещены в Вознесенском храме уже закрытого Знаменского монастыря города Осташкова, в котором разместилась экспозиция местного краеведческого музея. Нило-Столобенская обитель была разграблена, из монастыря новые властители изъяли более 33 пудов серебра, два фунта драгоценностей. В 1928 году в монастыре отслужена последняя литургия. Монастырь был закрыт, а на его территории разместилась вначале трудовая коммуна, а затем колония малолетних преступников. С сентября 1939 года по май 1940 года корпуса монастыря используются как лагерь для военнопленных. Здесь содержались в заключении военнопленные войска польского, которые в мае 1940 года почти все были расстреляны. С 1941 по 1945 годы монастырские корпуса переоборудованы под военный госпиталь. С конца 1945 года на территории монастыря повторно разместили колонию для несовершеннолетних. А в 1960 году в монастырских корпусах разместили дом престарелых. В 1960-е годы государство взяло комплекс монастыря под охрану как памятник архитектуры. С 1971 года обитель перешла в ведение Центрального совета по туризму и экскурсиям ВЦСПС, и здесь в уцелевших к тому времени монастырских строениях открывают турбазу "Рассвет". И уже к 1988 году они приходят в полный упадок, и дальнейшее использование их без капитального ремонта становится невозможным. В 1990 году решением Совета министров РСФСР комплекс Нило-Столобенской пустыни был передан в пользование Русской Православной Церкви. В 1991 году первую литургию в Благовещенском приделе Богоявленского собора обители совершает архиепископ Тверской и Кашинский Виктор (Олейник). В 1995 году состоялось торжественное перенесение святых мощей преподобного Нила Столобенского из Осташкова в Нило-Столобенскую пустынь. В 2000 году состоялось прославление в числе новомучеников Российских пострижеников Ниловой пустыни: преподобномученика Виталия, священномучеников Петра и Вениамина. В 2003 году были обретены мощи святителя Нектария (Теляшина). Произошло это во время раскопок в подвальном помещении Богоявленского собора, где ныне и хранятся мощи.